Las técnicas PCR y qPCR y su papel en la recuperación de daños medioambientales

La técnica de PCR y qPCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction por sus siglas en inglés) es una técnica que fue desarrollada en la década de los 80 por Kary Mullis (Bartlett & Stirling, 2003). Su fundamento consiste en la amplificación de fragmentos específicos de ADN, permitiendo obtener millones de copias de estos fragmentos a partir de una pequeña muestra. La PCR es, sin lugar a duda, la técnica más importante y revolucionaria en el campo de la genética y de la biología molecular y su impacto ha sido tal que Kary Mullis fue galardonado con el premio Nobel de Química en 1993. Hoy en día es una técnica muy común y versátil teniendo innumerables aplicaciones en el análisis genético en campos tan variados como la medicina, las autopsias, las investigaciones forenses, la arqueología u otro tipo de investigaciones básicas en biología molecular.

En la PCR se simula en un vial lo que ocurre durante la replicación celular en la que una enzima, la ADN polimerasa, actúa para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde. Un paso fundamental en el diseño experimental es la elección de los iniciadores (primers en inglés). Los iniciadores son oligonucleótidos (pequeños fragmentos de ADN) sintetizados artificialmente con un tamaño de 20-30 pares de bases que son elegidos durante el diseño experimental de forma que delimiten el fragmento de ADN a ser amplificado. Estos iniciadores se caracterizan por ser altamente específicos, amplificando únicamente la región de interés. Así, para cada fragmento de ADN que se quiere amplificar es necesario un par de iniciadores: uno complementario al extremo 5’ de una cadena de ADN y el otro complementario al extremo 3’ de la otra cadena (Figura 1). Además de seleccionar el fragmento a ser amplificado, los iniciadores son el punto de partida a partir del cual la ADN polimerasa iniciará la síntesis de nuevas cadenas.

Antes de realizar la reacción de PCR es necesario obtener el ADN de las muestras a analizar. Se puede extraer ADN de cualquier muestra que contenga material biológico: sangre, saliva, suelo, agua, etc, siendo el paso crítico para obtener muestras de suficiente calidad para su posterior análisis por PCR. La extracción de ADN a partir de muestras ambientales es particularmente complicada debido a la presencia de numerosos inhibidores de la reacción de PCR, como los ácidos húmicos y fúlvicos, así como otras sustancias orgánicas, iones metálicos o impurezas químicas que precipitan junto con el ADN (Desai et al., 2010). 

La reacción de PCR se realiza en equipos denominados termocicladores que someten las muestras a diferentes temperaturas correspondiendo a tres fases de la reacción: desnaturalización, alineamiento y extensión (Figura 1). 

Fases de la reacción de PCR.
Figura 1. Fases de la reacción de PCR.

Así, la reacción de PCR se inicia con la desnaturalización en la que la doble hélice del ADN extraído es separada mediante el calentamiento a una temperatura elevada (95 °C), produciéndose cadenas simples que quedan como molde para la síntesis de nuevas cadenas de ADN complementarias. Una vez separadas las cadenas, se baja la temperatura hasta 40-72 °C lo que permite el alineamiento y la unión específica de los iniciadores en los puntos correspondientes de las cadenas de ADN. Finalmente tiene lugar la extensión a 68-72 °C en la que la enzima ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas a partir de los iniciadores teniendo como molde las cadenas simples. Estos tres pasos de la reacción corresponden a un ciclo y son repetidos sucesivamente hasta completar alrededor de 30 ciclos. Los fragmentos amplificados aumentan su concentración de forma exponencial ya que cada nueva copia sirve de molde en los ciclos consecutivos, obteniéndose de esta forma millones de copias del fragmento de ADN de interés. En caso de ausencia de detección del producto amplificado y excluida la hipótesis a través de un control positivo de un fallo de la reacción por la presencia de inhibidores o deficiencia en algún reactivo, se puede concluir que la muestra no contiene la región de ADN de interés.

La detección de la presencia/ausencia de fragmentos de ADN es una herramienta clave permitiendo, por ejemplo, confirmar la existencia de ciertas especies de microorganismos como patógenos para la salud humana o como los microorganismos responsables de la degradación de algún compuesto contaminante. De esta forma, es posible identificar ciertos patógenos peligrosos o evaluar la efectividad de una microbiota en los procesos de biorremediación.

La PCR cuantitativa (qPCR de quantitative PCR en inglés) o PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación de ADN y su detección en un mismo paso, al correlacionar el producto de PCR amplificado en cada uno de los ciclos con una señal de fluorescencia. Esta técnica permite visualizar la reacción en tiempo real y, cuantificar con precisión el ADN de interés presente en la muestra.

La reacción de qPCR se realiza en un termociclador que incluye una unidad óptica capaz de detectar señales de fluorescencia (fluorómetro). El sistema fluorométrico consiste en una fuente de energía que excita los fluoróforos (grupos funcionales de una molécula que hacen que ésta sea fluorescente) a una determinada longitud de onda de excitación y un sistema de detección que permite medir la señal emitida a una cierta longitud de onda de emisión.

De esta forma, la reacción de qPCR sigue el mismo proceso de una reacción de PCR normal sucediéndose ciclos de desnaturalización, alineamiento y extensión. Sin embargo, a medida que se van amplificando los fragmentos de ADN, el compuesto fluoróforo se va uniendo y activando, aumentando la señal de fluorescencia emitida.

En el análisis de los datos, el valor Ct (cycle threshold en inglés) es el parámetro más importante en la cuantificación de ADN por qPCR. El valor Ct es el número de ciclos necesarios para que se produzca un aumento de fluorescencia significativo con respecto a la señal base, o sea, es cuando la señal de fluorescencia pasa un cierto umbral (Figura 2). Este parámetro es inversamente proporcional a la cantidad inicial del ADN de interés, ya que cuanto mayor sea la cantidad de ADN presente en una muestra, menor será el número de ciclos (valor Ct) que se requiere para alcanzar el umbral. De esta forma, a partir del valor Ct se puede cuantificar la cantidad de ADN.

 Determinación del valor Ct durante el análisis de los resultados de qPCR.
Figura 2. Determinación del valor Ct durante el análisis de los resultados de qPCR.

El análisis de la presencia y abundancia de ADN por qPCR es un análisis sensible. Es necesario contar con un diseño experimental previo que optimice la generación de datos y análisis de resultados, incluyendo todos los controles necesarios para asegurar la especificidad de los productos de amplificación, así como llevar a cabo triplicados para certificar la reproducibilidad de los resultados. 

qPCR aplicada en biorremediación

La recuperación de suelos y aguas contaminados utilizando microorganismos tiene hoy en día una gran aceptación al ser una estrategia sostenible a nivel técnico-económico y ambiental. Es por ello que, a día de hoy, el 50% de las técnicas propuestas para recuperar emplazamientos contaminados a nivel mundial pertenecen al área de la biorremediación.

Los métodos moleculares como la PCR y qPCR ofrecen la posibilidad de conocer la diversidad de la población microbiana y sus distintas capacidades metabólicas durante los procesos de biodegradación, haciendo posible la identificación de los microorganismos predominantes y activamente involucrados en la biorremediación de diversos contaminantes (Morelli et al., 2015).

La utilización de la técnica de qPCR en proyectos de biorremediación proporciona información precisa tanto para la fase de diseño y planteamiento de la estrategia de remediación como para la fase de seguimiento del proceso de recuperación del emplazamiento contaminado. 

En este contexto, la qPCR permite verificar la existencia y cantidad suficiente de poblaciones específicas de microorganismos que son responsables de la degradación del contaminante objetivo, así como cuantificar los genes que producen las enzimas que son clave en la ruta metabólica de degradación de dicho contaminante. En base a esta información, se decidirá la necesidad de aplicar un tratamiento de bioestimulación o bioaumentación con el fin de desarrollar con éxito el proceso de remediación.

Antes de empezar a escala real el proceso de biorremediación es necesario un estudio previo de microcosmos para determinar la viabilidad y efectividad de las opciones de tratamiento planteadas bajo las condiciones existentes en el emplazamiento. Este estudio permite verificar si tiene lugar una degradación efectiva del contaminante y descartar posibles inhibiciones de los microorganismos involucrados en el proceso debido a la naturaleza y composición de la matriz donde ha tenido lugar la contaminación. La aplicación de la técnica qPCR durante el ensayo de microcosmos permite monitorizar la evolución de la comunidad microbiana y de los genes productores de enzimas implicadas en la ruta metabólica del contaminante. 

Así, durante el proceso de biorremediación se puede monitorizar mediante esta técnica las poblaciones y los genes involucrados en la degradación del contaminante. Su evolución indicará si el tratamiento está funcionando correctamente o si se está produciendo alguna limitación en algún paso crítico de la ruta metabólica que, una vez identificado, puede ser abordado y resuelto rápidamente maximizando la tasa de eliminación del contaminante.

El seguimiento de especies concretas durante un proceso de degradación tiene una importancia clave en aquellas rutas metabólicas en las que la degradación de uno de los contaminantes parentales o intermediarios se lleva a cabo exclusivamente por una única especie de microorganismo. La ausencia de dicha especie daría lugar por tanto a la acumulación de ese producto intermedio y por tanto al bloqueo en la mineralización completa del contaminante hasta productos inocuos. Un ejemplo claro de este escenario se da durante la biodegradación anaerobia de compuestos clorados. En este proceso están involucradas varias especies microbianas que transforman sucesivamente el percloroetileno (PCE) en tricloroetileno (TCE), el TCE en cis-1,2-dicloroetileno (cis-DCE), después en cloruro de vinilo (VC del inglés vinyl chloride) y, finalmente, en etileno (Figura 3). El compuesto VC es aún más tóxico que el PCE y TCE, así que evitar la acumulación de este producto intermedio en la ruta de degradación es de vital importancia para no aumentar la toxicidad asociada a la presencia de compuestos clorados en el emplazamiento. Este paso es crítico ya que solo las especies pertenecientes a los géneros Dehalococcoides cuentan con las enzimas necesarias para llevar a cabo la transformación completa de VC en etileno (Lee et al., 2008, Manchester et al., 2012). 

Ruta metabólica durante la biodegradación del percloroetileno hasta etileno.
Figura 3. Ruta metabólica durante la biodegradación del percloroetileno hasta etileno.

De esta manera, la técnica qPCR representa una herramienta fundamental en la descontaminación de compuestos clorados ya que permite cuantificar el número de copias de las especies clave involucradas en los distintos pasos de la ruta metabólica y monitorizar si se produce un crecimiento de su población para asegurar la degradación completa del PCE hasta el etileno.

Por tanto, la técnica qPCR es una herramienta que aporta una valiosa información sobre la comunidad microbiana y su capacidad metabólica. Su aplicación durante el diseño y el seguimiento del tratamiento microbiológico permite detectar desviaciones que pueden ser corregidas de forma rápida, contribuyendo así al éxito de la biorremediación.

Bibliografía

Bartlett, J., D. Stirling (2003) A Short History of the Polymerase Chain Reaction, Methods in Molecular Biology, 226, pp. 3-6.

Desai, C., H. Pathak, D. Madamwar (2010) Advances in Molecular and «-Omics» Technologies to Gauge Microbial Communities and Bioremediation at Xenobiotic/Anthropogen Contaminated Sites, Bioresource Technology, 101(6), pp. 1558-1569.

Lee, P. K., T. W. Macbeth, K. S. Sorenson, Jr., R. A. Deeb, L. Alvarez-Cohen (2008) Quantifying Genes and Transcripts to Assess the In Situ Physiology of «Dehalococcoides» spp. in a Trichloroethene-Contaminated Groundwater Site, Applied and Environmental Microbiology, 74(9), pp. 2728-2739.

Manchester, M. J., L. A. Hug, M. Zarek, A. Zila, E. A. Edwards (2012) Discovery of a trans-Dichloroethene-Respiring Dehalogenimonas Species in the 1,1,2,2-Tetrachloroethane-Dechlorinating WBC-2 Consortium, Applied and Environmental Microbiology, 78(15), pp. 5280-5287.

Morelli. I. S., B. M. Coppotelli, L. Madueño, M. T. Del Panno (2015) La Biorremediación en la Era Post-Genómica, Revista Química Viva, 1(14), pp. 26-35.